病毒培養簡介

更新日期: 2017/10/9

把之前拍的一些正常細胞的照片整理了一下，加上註解做成一個照片集錦重新發佈，順便大概介紹一下病毒培養，不過後來新發的文裡都有重覆寫過，想說這樣整篇文章比較完整，不會變成單獨看一篇文章看不懂

病毒培養的檢驗是經由讓病毒感染特定的細胞之後，病毒在細胞內增殖，使細胞產生特殊的細胞病變，表現為細胞皺縮、變圓、出現空泡、融合、死亡和脫落，稱之為細胞病變效應(cytopathic effect; CPE)。以光學倒立顯微鏡來觀察上述細胞病變，再用免疫螢光法(immunofluorescence assay; IFA)染色做確認，在螢光顯微鏡下可見黃綠色螢光，依所選用抗體的特異性，即可正確判斷為何種病毒感染

常用在病毒培養的細胞，其中五種，如下
1. HEL ( Human Embryonic Lung Cell )
    Organism: Homo sapiens, human / Tissue: lung

2. HEp-2 ( Human Epithelial Cell-2 )
    Organism: Homo sapiens, human / Tissue: HeLa contaminant 

3. RD ( Rhabdomyosarcoma Cell ) 
      Organism: Homo sapiens, human / Tissue: muscle 

4. LLC-MK-2 ( LLC-Monkey Kidney Cell-2 )
      Organism: Macaca mulatta, monkey, rhesus / Tissue: kidney

5. MDCK ( Mardin-Darby Canine Kidney Cell )
      Organism: Canis Familiaris / Tissue: kidney

對於無細胞病變(non-cytopathogenic)或只有輕微細胞病變之病毒，特別是parainfluenza及mumps virus，可利用血球吸附試驗 (hemadsorption test, HAd)來檢測其存在

如何看病毒培養的 CPE請參照另外一篇 新手上路看CPE

血球吸附試驗 (hemadsorption test, HAd)

更新日期: 2017/12/31

血球吸附試驗 (hemadsorption test, HAd)

流感病毒和某些副粘液病毒在感染細胞後24-48小時，新合成的血球凝集素 (hemagglutinin, H) 表現在細胞膜上，能吸附天竺鼠、雞等動物及人類的紅血球，而產生紅血球吸附現象。對於無細胞病變或只有輕微細胞病變之病毒，利用血球吸附現象，可以檢測病毒的存在；對於有細胞病變的病毒，亦可藉之早期偵測。

資料來源: https://www.nics.org.tw/old_nics/magazine/16/02/16-2-7.htm

以下照片中的HAd是使用天竺鼠的紅血球，在正立光學顯微鏡下所觀察到的血球吸附現象

HAd Test陽性：MDCK細胞 monolayer 上吸附有RBC

HAd Test陽性：MDCK細胞 monolayer 上吸附有RBC

HAd Test陰性：MDCK細胞 monolayer 沒有吸附RBC

HAd Test陰性：MDCK細胞 monolayer 沒有吸附RBC

以下照片為HAd Test陽性：MK-2細胞 monolayer 上吸附有RBC
螢光染色結果為Parainfluenza II

HAd Test陽性：MK-2細胞 monolayer 上吸附有RBC

HAd Test陽性：MK-2細胞 monolayer 上吸附有RBC

HAd Test陽性：MK-2細胞 monolayer 上吸附有RBC

HAd Test陽性：MK-2細胞 monolayer 上吸附有RBC

                                                                                     

HAd Test陽性：MK-2細胞 monolayer 上吸附有RBC

感謝柏彰幫忙拍攝這些非常清楚的照片!

Influenza Viruses (流行性感冒病毒)

流行性感冒病毒分為A, B, C三型, 其中A型和B型對人類有較高的致病性, 由於A型具有 "antigenic shift", 抗原變異性大, 所以每隔數十年就會發生一次全球性的大流行, 1918年、1957 年、1968年以及1977年都曾發生過大流行，其中尤以1918年所謂“Spanish flu”的全球流行死亡最為慘重，造成至少 2 千萬人以上死亡，且死亡年齡層以二十至四十歲青壯年為主

流行性感冒病毒是有八條單股RNA的RNA病毒, 病毒的表面上有血球凝集素 (hemagglutinin, H) 和神經氨酸酶 (neuraminidase, N), 血球凝集素能幫助病毒附著在細胞上, 相反的, 神經氨酸酶則作用於病毒離開宿主細胞時, 兩者都被視為流行性感冒病毒的抗原, 並以此兩者作為病毒的編號，例如A型流感H1N1

CPE照片分享 - Adenoviruses (腺病毒)

Adenoviruses (腺病毒)

Ø  腺病毒具有雙股DNA，中等大小（90-100nm），無包膜的二十面體病毒。超過50種類型的免疫學特異性腺病毒可引起人類感染。

Ø  任何人都可能感染腺病毒，但大部份的病人並不會有嚴重的症狀

Ø  腺病毒的傳染途徑通常是經由觸摸或握手，咳嗽打噴嚏，或觸摸到物體表面上的腺病毒，然後再去觸摸你的嘴，鼻子或眼睛

Ø  腺病毒最常引起呼吸道疾病。疾病可以從普通感冒到肺炎，咳嗽和支氣管炎。根據類型，腺病毒可能會導致其他疾病，如腸胃炎，結膜炎，膀胱炎，較不常見的是神經系統疾病。

Ø  腺病毒目前並沒有疫苗

Ø  腺病毒對一些常見的消毒劑具有一定的耐受性，因此，在泳池中加入足夠的氯是很重要的，可防止由腺病毒引起的結膜炎的爆發

Ø  目前對腺病毒患者並沒有特別的治療。大多數腺病毒感染是輕度的，只需要緩解症狀

Ø  免疫系統較弱的嬰兒和人群，較容易因為腺病毒感染而引發嚴重疾病

Ø  腺病毒的感染可經由抗原檢測 (antigen detection)，PCR，病毒培養 (virus isolation) 和血清學來鑑定。腺病毒分型通常是利用血細胞凝集抑制和/或用特異性抗血清中和 (hemagglutination-inhibition and/or neutralization with type-specific antisera)或是用分生的方法 (molecular methods)

以上資料節錄自美國CDC網頁https://www.cdc.gov/adenovirus/

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病毒培養的檢驗是經由讓病毒感染特定的細胞之後，病毒在細胞內增殖，使細胞產生特殊的細胞病變，表現為細胞皺縮、變圓、出現空泡、融合、死亡和脫落，稱之為細胞病變效應(cytopathic effect; CPE)。以光學倒立顯微鏡來觀察上述細胞病變，再用免疫螢光法(immunofluorescence assay; IFA)染色做確認，在螢光顯微鏡下可見黃綠色螢光，依所選用抗體的特異性，即可正確判斷為何種病毒感染。以下是在做Adenoviruses培養時，其CPE在倒立顯微鏡下所觀察到的形態

以下照片中所用到的相關縮寫如下:

HEL ( Human Embryonic Lung Cell )

HEp-2 ( Human Epithelial Cell-2 )

CPE (Cytopathic effect)

Ad (Adenoviruses)

CMV (Cytomegalovirus)

Adenoviruses (HEp-2 cell) 的螢光染色

CPE照片分享 - 水痘帶狀疱疹病毒（Varicella-Zoster virus；VZV）

水痘帶狀疱疹病毒（Varicella-Zoster virus；VZV）

水痘帶狀皰疹病毒Varicella-Zoster Virus (VZV)

Human alpha-herpesvirus

–       造成水痘（varicella）和帶狀皰疹（herpes zoster）

–       原發性VZV感染導致水痘

–       原發性VZV感染後，會潛伏在背根神經節（dorsal root ganglia）

–       VZV復發時，會引發帶狀皰疹

–       在美國有3種許可的疫苗可以預防水痘（Varivax®，Proquad®）和帶狀皰疹（Zostavax®）

–       Varivax® (1995授權)

–       Proquad® (2005授權)

–       Zostavax® (2006授權)

節錄自美國CDC於2013發表的文章，原文網址: https://www.cdc.gov/vaccines/vpd-vac/shingles/downloads/vzv_clinical_slideset_jul2010.pdf

Laboratory Testing

如果對VZV病毒培養以外的實驗室檢測方法有興趣 (如IgG ELISA等)，可參考美國CDC的網頁，網址如下

https://www.cdc.gov/chickenpox/hcp/lab-tests.html

在水痘復原之後，藉潛伏於寄主的神經節中，以避免被免疫系統摧毀。當宿主免疫力減弱時，病毒便會活化並沿其分布的神經皮節散布，則會造成帶狀疱疹，俗稱皮蛇（shingles）。屬於第四類法定傳染病。

節錄自 衛生福利部疾病管制署

病毒培養的檢驗是經由讓病毒感染特定的細胞之後，病毒在細胞內增殖，使細胞產生特殊的細胞病變，表現為細胞皺縮、變圓、出現空泡、融合、死亡和脫落，稱之為細胞病變效應(cytopathic effect; CPE)。以光學倒立顯微鏡來觀察上述細胞病變，再用免疫螢光法(immunofluorescence assay; IFA)染色做確認，在螢光顯微鏡下可見黃綠色螢光，依所選用抗體的特異性，即可正確判斷為何種病毒感染。以下照片是在做Varicella-Zoster Virus培養時，其CPE在倒立顯微鏡下所觀察到的形態

HEL ( Human Embryonic Lung Cell ) 細胞受到VZV感染後，約數天後出現細胞病變，局部細胞變圓、大小不等，約再1至2天後，細胞變破碎，呈砂粒狀

下圖是正常的HEL細胞照片, 可與上方照片做比對

VZV的螢光看起來碎碎的，與其他病毒的螢光為完整的細胞不太一樣，有點像腸病毒的非特異性螢光 (下面的照片是VZV陽性的螢光染色，細胞為HEL)

CPE照片分享 - 補上Respiratory Syncytial Virus (RSV, 呼吸道融合病毒)在HEp-2細胞的照片

                                                                                    (更新日期: 2017/12/21)

RSV在HEp-2細胞上, 開始讓細胞融合成一片, 多角形漸漸消失, 有些已經聚集成球狀(油滴狀), 原本密實的細胞開始出現空洞

RSV在HEp-2細胞上, 開始讓細胞融合成一片

RSV在HEp-2細胞上, 開始讓細胞融合成一片

以上的情況再養久一點, 就會變成下面這樣, 球狀的部份會愈來愈像油滴狀, 亮亮的, 最後會掉下來, 浮在培養基裡, 像漂浮的油滴

RSV在HEp-2細胞

感謝103學年(2017) 實習學生毓麒同學幫忙拍攝以下照片!

RSV在HEp-2細胞上造成像油滴狀的CPE

RSV在HEp-2細胞的邊緣造成像油滴狀的CPE

RSV在HEp-2細胞上造成像油滴狀的CPE (懸浮在培養液中的樣子)

RSV在HEp-2細胞上造成像油滴狀的CPE

新手上路看CPE (Cytopathic effect)

剛開始要做病毒培養時，最擔心的就是怕自己沒有看出CPE (Cytopathic effect)，那麼看CPE有哪些要注意的呢?

看CPE的第一條守則就是「記得要先看blank (陰性對照細胞)」，每天接種檢體時，我們會同時放一組blank一起培養，當你不確定這個變化到底是不是CPE時，把它跟blank放在一起對照著看，看blank是不是也有一樣的變化，會很有幫助，因為細胞會老，而且培養的環境跟細胞的狀況等等，都會影響到細胞的形態，因此，只要blank也有的，就不用太擔心它是CPE，當然如果真的有懷疑，還是可以先做記號，多觀察幾天，千萬不要心急，因為太早染色容易槓龜，看得太慢, 常常一不小心就整排細胞都做了記號，所以盡量以正常的速度看過去, 覺得怪的, 就做記號, 但, 正所謂師父領進門，修行靠個人，如何減少不必要的記號，就要靠經驗的累積了, 不要害怕槓龜, 槓龜是正常的, 因為細胞是活的, 病毒是活的, 不同的條件下出現的CPE必然不會一模一樣, 凡事都有例外!

看CPE的第二條守則就是「如果是CPE，一定會變多」，有時細胞會因為某些因素，也可能因為檢體本身造成的一些變化，一開始真的會非常困擾，此時，又是作記號的時候了，看看它有沒有變多，如果真的是CPE，一定會變多，如果這樣的變化已經嚴重影響到細胞的生長時，那麼，就種第二代 (把病毒接種到新的細胞)，如果真的是CPE，它很快就會再出現的

在HEL上，看起來像是有變化，但是待觀察的細胞

 接下來，我們來看看一些可惡的冒牌貨，它們其實不是CPE，但是最愛唬弄新人

HEL上粘了一些檢體細胞，跟CPE的區分方法 -- 不會變多，與細胞不在同一個焦距上

HEL上偶發出現的細胞紋路，通常同一批細胞都會出現，可跟blank對照看

HEL上偶發出現的細胞紋路，通常同一批細胞都會出現，可跟blank對照看

MK-2細胞因為本身有內生性病毒，因此都會出現這樣的CPE，這不是我們要找的檢體CPE

MDCK本身就有的紋路

HEp-2細胞老化很快，因此經常會看到很多變圓的細胞浮在上面，此時我們要注意看的是下方的多角形細胞是否都還完整

HEp-2 的老化細胞也是會變圓的 (照片上箭頭指的那些)，注意看，變圓的細胞下面，多角形都還在，並沒有變化，不是CPE，下面如果不好看，也可以看邊緣

從相同的細胞上找出真正的CPE之後 (就是找出不一樣的那支) , 除了依照CPE的形態來推測它是什麼之外, 接下來就是檢視同一個檢體的不同細胞的變化, 找出一支適合拿來染色的, 同時也可幫助確認自己的推測是否正確, 有些病毒在別的細胞上會有不一樣的CPE, 有些病毒的特色就是只在特定的細胞上會長CPE (如CMV, VZV, 只會在HEL上有變化, HEp-2, RD等細胞就不會有變化)

以下另外附上一些其它細胞及CPE的照片連結:

1. 一些正常細胞的照片, 常用的細胞株及其來源
2. hemadsorption test, HAd (血球吸附試驗)
3. Adenoviruses (腺病毒)
4. Varicella-Zoster virus, VZV（水痘帶狀疱疹病毒）

5. Respiratory Syncytial Virus (RSV, 呼吸道融合病毒)
6. Respiratory Syncytial Virus (RSV, 呼吸道融合病毒)在HEp-2細胞的照片

7. Cytomegalovirus (CMV, 巨細胞病毒)

8. 腸病毒 (Enterovirus)

9.細胞培養的操作影片

這些經驗分享, 講起來很簡單, 但是實際上的變化還是很多, 槓龜事件還是經常發生, 經驗需要慢慢累積, 或許在這科技日新月異的時代, 等我終於不會再槓龜的時候, 病毒也都不需要培養了......不論如何, 管好眼前的每一天, 也對每一天的自己負責, 好好的把自己每一天的工作做好就好, 明天的事, 誰能預料呢! 今天的努力, 或許現在沒有收穫, 誰又知道在未來的哪一天, 不會派上用場呢!

🧸CPE練習小工具   DEMO版 (鴨鴨工具箱 — 第3號小工具)

功能介紹連結(https://lateral-climb-780.notion.site/v5-0-292adf36d9ce80aa8355c1fe71ad8590?source=copy_link)